肠道菌群是一个复杂的生态系统，对宿主的健康十分重要，可以抵御病原体的侵害，帮助消化并从食物中吸收能量，刺激免疫反应等；同时肠道微生物的结构也与一些疾病的发病机理相关，例如腹泻就是一个与肠道相关的疾病。

犬类腹泻一般是由于细小病毒以及一些细菌、寄生虫传播以及食物不耐症所导致，这对犬类的健康极为不利。故本实验采用犬类作为研究对象，观察益生菌Probio-Fit?对犬类腹泻以及肠道菌群的改善以及调节作用。这也为益生菌Probio-Fit?对其他宠物以及人类健康的改善作用提供预测。

实验方法

在北京附近的犬类训练基地，选取40只腹泻犬参与实验（表1）

表1.参与实验的犬类详情

实验过程

将腹泻犬按照1：1的比例随机分成治疗组和对照组，由于不同年龄犬类体重差异较大，所以给治疗组犬类服用益生菌Probio-Fit?的用量也有所不同，其中：

老年犬（大于5岁）：Probio-Fit?10g／天；

成年犬（2-5岁）：Probio-Fit?2g／天；

幼年犬（6个月-2岁）：Probio-Fit?4g／天。

经过60天的动物实验，分别对实验前后腹泻症状的改善情况进行评分，并采集实验前后犬类的粪便样本，对肠道微生物多样性、结构、功能基因以及相关性等进行分析（图1）。

注：Probio-Fit?中含有三种益生菌(L. caseiZhang 3×109CFU/g；L. plantarumP-8 3×109CFU/g；B. lactisV9 4×109CFU/g)

图1:犬类实验设计详情

实验结果

01、腹泻症状改善情况分析

在经过益生菌Probio-Fit?干预治疗第60天后，治疗组犬类腹泻比例(10%)显著低于对照组水平(55%)（P=0.002，图2）。此外没有发现一只犬在接受益生菌治疗后出现腹泻加重的情况，相反对照组中有两只犬出现了腹泻症状加重的情况。表明益生菌Probio-Fit?干预治疗可以有效改善犬类腹泻症状。

图2:腹泻症状改善详情

02、肠道菌群多样性及物种差异分析

分别对比治疗组和对照组腹泻犬类肠道菌群的Shannon指数和Simpson指数发现，对照组肠道菌群多样性在实验阶段显著下降（Shannon指数：P<0.0001; Simpson指数：P<0.001)，而治疗组的多样性呈上升趋势（图3A、B）。在第60天，治疗组的Shannon指数（Shannon指数：P<0.01）和Simpson指数（Simpson指数：P<0.001）均显著高于对照组。

为了评价益生菌Probio-Fit?对犬类肠道菌群的调节作用，采用基于物种丰度Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)，我们观察到第0天和第60天，治疗组犬类的肠道菌群结构存在显著差异(F=2.13；P=0.041)，而对照组在不同时间内的差异并不明显(F=1.22；P=0.25)（图3C、D）。这表明益生菌Probio-Fit?可以有效调节犬类肠道菌群，提高肠道微生物多样性。

图3: A. Shannon指数详情B. Simpson指数详情C、D.物种丰度差异PCoA主坐标分析

03、肠道菌群结构变化

治疗组在60天后肠道微生物存在显著差异，这是由于物种丰度变化所致。实验期间，治疗组和对照组在门水平上均无明显变化，但属的水平上存在差异。两组中梭菌属、肠球菌属和链球菌属数量明显减少。治疗组的乳酸杆菌和双歧杆菌的相对丰度显著增加(P<0.01)，且在第60天时，治疗组的类杆菌(P<0.05)、双歧杆菌(P<0.05)和消化链球菌(P<0.01)明显多于对照组（图4A）。

在物种水平上，治疗组老年犬中产气荚膜梭菌和粪肠球菌数量明显减少(P<0.05)，同时增加了动物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌的数量（图4B）；治疗组幼年犬中，动物双歧杆菌(P<0.05)、约翰逊乳杆菌(P<0.05)显著增加，而毛肠短状螺旋菌和犬螺旋杆菌相对丰度显著降低（P<0.05；图4C）；治疗组成年犬中，第60天嗜酸乳杆菌(P<0.05)、动物乳杆菌(P<0.05)、罗伊氏乳杆菌(P<0.01)、约翰逊乳杆菌(P<0.05)和双歧杆菌的相对丰度明显高于对照组（P<0.05；图4D）。

益生菌Probio-Fit?可以有效改善肠道菌群，显著降低链球菌属、梭菌属、螺旋菌属等（诱发溃疡性结肠炎，具有天然耐药性）有害致病菌的含量；显著增加类杆菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属（包括罗伊氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌、约翰逊乳杆菌）等有益菌的含量。进而促进食物的代谢分解，抑制病原微生物，降低细胞促炎因子。

图4:实验前后犬类肠道菌群结构变化详情

04、功能基因的变化和相关性验证

根据试验前后，功能基因的Shannon指数和Simpson指数显示，治疗组的功能基因多样性有所增加。功能属性方面，治疗组老年犬中氨基酸代谢途径、辅酶和维生素代谢途径、聚糖生物合成代谢途径丰度显著高于对照组(P<0.05)；膜运转和转录途径相对丰度下降。治疗组成年犬中有关翻译、复制、修复相关通路明显增加；细胞信号传导、细胞运动等通路明显下降。治疗组幼年犬中有关能量代谢、环境适应、免疫系统等相关途径明显提升。

为了探寻菌种与功能基因的关联，通过Spearman相关性分析，发现动物双歧杆菌、约翰逊乳杆菌、罗伊氏乳杆菌和嗜酸乳杆菌与氨基酸代谢呈正相关，与细胞运动、细胞信号传导等呈负相关（图5）。

图5:菌种与功能基因相关性详情

这表明益生菌Probio-Fit?可以提升有关氨基酸代谢、辅酶和维生素代谢等有益代谢途径的丰度，从而产生更多对宿主有益的氨基酸以及次级代谢产物等，促进营养物质吸收。另一方面减少细胞运动以及细胞信号传导等通路，从而减少致病菌在体液中的运动与扩散。

实验结论

益生菌Probio-Fit?可以有效改善和缓解犬类腹泻症状并调节肠道菌群；提高犬类肠道微生物多样性；调节肠道菌群，提高双歧杆菌属、类杆菌属、乳杆菌属等有益菌含量，降低螺旋菌属、链球菌属等致病菌含量。益生菌Probio-Fit?还可以有效提高氨基酸代谢等有益途径的丰度，从而促进肠道消化和吸收。