在PD-1/PD-L1靶点大火之后，面对拥挤的PD-1赛道，与PD-1同属免疫检查点的其它靶点，如LAG-3、TIGIT等也逐步走入了相关药企和诊断企业的视线。今年3月，Relatlimab获FDA批准，与抗PD-1药物Nivolumab联合，用于治疗12岁以上不可切除或转移性黑色素瘤的成人与儿童患者。随着首款获批LAG-3抗体的诞生，该靶点也受到了更为广泛的关注。

在LAG-3检测方法和伴随诊断的开发中，一些重要的问题值得进行深入的讨论，比如LAG-3究竟如何抑制T细胞？LAG-3药物往往与PD-L1/PD-1药物联用或者开发双抗，那么两个靶点的分层分析以及伴随诊断开发有什么特点？本文将在介绍LAG-3靶点的基础上进一步就这些问题做一些探讨。

01 LAG-3简介和机制探讨

LAG-3（淋巴细胞激活基因3）是一种细胞表面分子，对T细胞功能具有多种生物学效应，是药企寻求开发肿瘤和自身免疫性疾病新疗法的重要靶标。LAG-3 （CD223）蛋白属于免疫球蛋白(Ig)超家族，是一种I型跨膜蛋白，具有四个细胞外Ig样结构域，称为D1至D4。LAG-3的胞外区与CD4具有约20%的氨基酸同源性。

LAG-3在活化的T细胞、NK细胞、B细胞和浆细胞样树突状细胞等上表达。此外，据报道，LAG-3在神经元上也表达。

截至目前，主流观点认为LAG-3的主要配体是MHC II，LAG-3与MHC II结合的亲和力高于CD4。其它配体包括：FGL1及LSECtin等。LAG-3以与CTLA-4和PD-1类似的方式负调节T细胞的细胞增殖、活化和稳态。

LAG-3究竟如何抑制T细胞？研究人员们对LAG-3机制的探索从未停止。有研究者推测，LAG-3与MHC-II相互作用以阻止同一MHC分子与TCR和CD4结合，从而直接阻碍免疫反应中的TCR信号传导。同时，该研究团队也表示，LAG-3的确切信号转导机制仍待进一步研究。此外，有研究者认为LAG-3可能并非通过CD4竞争性抑制的机制来抑制T细胞的活化，LAG-3选择性结合稳定的pMHCII并抑制识别稳定pMHCII的CD4+ T细胞的活化。

今年4月，一篇发表于Nature Immunology的文章提示，在没有MHC II结合的情况下，LAG-3与TCR–CD3复合物相关，通过驱动共受体Lck解离来抑制信号传导，从而抑制T细胞的活性。

图1：LAG-3与MHC II的相互作用

图2：LAG-3选择性结合稳定的pMHCII并抑制T细胞活化

02 国内外药企布局靶向LAG-3的药物

LAG-3已然成为了广受药企关注的免疫靶点，那么，各大药企究竟在LAG-3靶点上发力几何呢？在此，我们在下表中列出了LAG-3靶向疗法的最新进展情况。

表1：LAG-3靶向药物开发的最新进展

从上表可以看出，目前主要有LAG-3单抗、LAG-3双特异性抗体、LAG-3融合蛋白这三类LAG-3相关药物正在临床开发中，具体每类药物的临床试验药物进展分析如下：

1 LAG-3单抗

LAG-3单抗主要通过靶向LAG-3，激活T细胞，从而激发人体的免疫系统。然而LAG-3单抗的研发之路充满了坎坷。基于对临床数据的评估，2021年，Immutep宣布授权合作伙伴GSK停止在活动性溃疡性结肠炎患者中评价LAG-3单抗药物GSK2831781（IMP731）的II期临床试验。由于LAG-3单抗单独用药在临床拓展中仍存在一些挑战，故而目前联用其它免疫检查点药物如PD-1药物是肿瘤免疫疗法提高临床疗效的常见策略。

因此，已有PD-1药物获批的药企，无疑在LAG-3靶点的单抗开发上占得先机。BMS最先着手研究LAG-3靶点，该公司开发的瑞拉利单抗(Relatlimab)与O药的联合用药，已在临床研究中证明了依从性和药物不良反应弱于该药企此前的Y药+O药的疗法，疗效上亦优于O药单用。

今年年初，Relatlimab与Nivolumab联合疗法用于未经治疗的晚期黑色素瘤的研究结果发布于新英格兰医学杂志。共有714名来自全球111个研究中心的晚期黑色素瘤患者参与了这项II/III期、双盲、随机临床试验，结果显示，Relatlimab–Nivolumab联合治疗组的中位无进展生存期为10.1个月，而Nivolumab单药治疗组为4.6个月。在第12个月的随访时，Relatlimab–Nivolumab联合治疗组的无进展生存率为47.7%，Nivolumab组为36.0%。

临床试验结果提示，在既往未经治疗的转移性或不可切除的黑色素瘤患者中，与抗PD-1单药治疗相比，抗LAG-3和抗PD-1联合治疗显示出更多的临床获益；同时，临床结果也显示，LAG-3高表达的患者对该药的反应更佳。

图3：Relatlimab–Nivolumab联合治疗组与Nivolumab组的无进展生存期

默沙东作为K药的生产商，LAG-3单抗favezelimab与K药联合的疗法在MSS CRC治疗中的1期临床结果评分优于标准疗法，目前已开始3期临床，有望成为下一个获批上市的LAG-3靶点药物。

此外，勃林格殷格翰公司的BI-754111联合自家PD-1单抗和VEGF/Ang2双抗的2期临床试验也已经启动。再生元公司开发了一款新颖的Zr-89标记抗LAG-3的单克隆抗体REGN3767，可用于癌症PET，也与自家的PD-1单抗组合进行了1期临床试验，试验结果较好，已启动了1/2期临床。

诺华、GSK、Incyte等国际药企也纷纷布局LAG-3靶点，均有单抗在研，目前大部分均与PD-1单抗联合用药，也有少数与TIM3等靶点联合用药，临床试验进展良好。

国内药企亦不乏LAG-3单抗管线，恒瑞和信达均有一款LAG-3单抗在研，与自家研发的PD-1单抗联合用药的1/2期临床进行中，目前安全性和耐受性良好。

百济神州则与维立志博合作开发LBL-007，联合了君实生物已上市的PD-1单抗进行联合用药，1/2期临床试验进行中。

2 LAG-3双抗

在今年的LAG-3靶向药物研发峰会（LAG3 Targeted Drug Development Summit）上，多个团队的研究者表示相比单抗或联合治疗，PD-1/LAG-3双特异性抗体或许更具优势。

一些药企选择了直接开发共靶点的双抗，代表公司是MacroGenics，该公司与再鼎医药合作研发的Tebotelimab是一款针对LAG-3/PD-1的双抗。这是一款双特异性四价的抗体，在抗体Fc区域增加了两个靶向LAG-3的蛋白域，能够同时驱动PD-1和LAG-3靶点下调，提供更持久的疗效。前期有研究结果表明，LAG-3高表达的患者对Tebotelimab的反应良好。目前，该药与MacroGenics公司的B7-H3单抗Enoblituzumab联用的2期临床研究正在国外开展。

岸迈生物基于专有的Fabs-In-Tandem免疫球蛋白技术，开发了一款同时靶向PD-1和LAG-3的双克隆抗体，目前体外研究认为有明确的抗肿瘤活性，1/2期临床研究已经完成首次给药。

罗氏，F-star Therapeutics等国际药企也拥有LAG-3和PD-1/PD-L1共靶点的双抗的管线，罗氏选择了与PD-1/TIM3双抗RO-7121661联用，F-star Therapeutics则选择了单独用药，现在已经进行到了2期临床。Xencor公司不走寻常路，开发了一款LAG-3和CTLA4共靶点的双抗，目前与K药联用的1期临床进行中。

3 LAG-3融合蛋白

除此之外，Immutep公司把目光投向了新颖的融合蛋白领域，开发了一款可溶性LAG-3融合蛋白IMP-321，IMP321属于可溶性重组LAG-3，可激活树突状细胞，诱导T细胞增殖。体外研究证明可用以诱导癌症患者对肿瘤持续发生免疫反应。该药与K药和紫杉醇的联用在2期临床试验中获得了积极的中期数据。

TACTI-003研究，即一项研究可溶性LAG-3融合蛋白Eftilagimod Alpha（IMP321）与Pembrolizumab联合治疗不可切除的复发性或转移性头颈部鳞状细胞癌的多中心、开放标签、随机、II期临床试验正在招募中（NCT04811027）。

图4：IMP321作用机制（Immutep公开资料）

根据目前全球进入临床阶段的LAG-3疗法公开信息分析（具体如下图所示）：整体看来，目前LAG-3靶点临床研究很多，其中8款处于1期临床试验阶段，13款进入2期（包括1/2期）临床试验，1款进入3期临床试验，1款已上市；LAG-3的药物类型目前以单抗类药物为主；与PD-1/PD-L1靶点的联用或共用最为常见，也有少数临床研究是与其它靶点比如TIM-3，CTLA-4联合。

图5：全球进入临床阶段的LAG-3疗法公开信息分析

随着第一款药物的上市，LAG-3靶点已成功证明了自身价值，作为新兴的蓝海市场，未来发展可期。在PD-1/PD-L1市场已接近饱和的局面下，无论国外老牌药企还是国内创新药企，都需要在新的免疫检查点上寻求突破。LAG-3目前进入临床阶段的15款单抗、7款双抗和1款融合蛋白，正在期待临床数据的验证。无论最终哪家药企能在LAG-3靶点上获得突破，都是肿瘤患者的福音。

03 LAG-3用于分层分析以双靶点 伴随诊断开发策略

在LAG-3相关疗法中，LAG-3表达检测对疗效评估具有非常重要的意义。在Relatlimab与Nivolumab联合治疗晚期黑色素瘤一文中，如下图所示，在两个治疗组中，LAG-3表达≥1%的患者组中位无进展生存期估计值更长。结果提示，LAG-3检测将有助于实现更好的患者分层，实现精准医疗。

图6：LAG-3表达分组的无进展生存期

实际上，这个临床试验里面对PD-L1和LAG3这两个靶点都进行分层分析，如果把数据综合来看，一方面观察不同亚组的差异，另一方面观察亚组内部双药与单药的差异，我们可以看到双靶点疗法的一些特点。

下图的表格汇总了不同的分层亚组PFS中位数的差异，我们可以看到不管是LAG-3阳性还是PD-L1阳性，相比阴性患者，不论双药还是单药PFS都显著延长；另一个角度，如果比较联用和单药的效果差异，我们可以观察到PD-L1阳性的亚组里面，双药和单药的差异其实相对不明显。

图7：LAG-3/PD-L1表达，采用单药/联合用药的患者PFS比较

施贵宝Relatlimab药物的研究实现了所有用药人群达到了临床终点，因此目前并没有LAG-3伴随诊断试剂盒的申报。但随着类似临床研究的涌现，我们会越来越多的遇到双靶点甚至多靶点用于患者筛选或者患者分层分析的情况，那么相应的伴随诊断开发也就会成为一个很关键的问题。

是否两个靶点都需要考虑申报伴随诊断？两个靶点申报伴随诊断时是否需要阐明相关关系？目前由于还没有实际申报的案例，我们可以从逻辑上做一些探讨，在总体上进行把握。有两个靶点的时候，我们可以用这个模型来考虑伴随诊断策略：

图8 ：双靶点伴随诊断策略框架

当然，这里没有探讨可以辅助用药决策的补充诊断，以及一个药物和相关伴随诊断已经上市 vs 两个靶点都没有上市等情况。在具体项目中甚至有可能涉及两家诊断企业甚至两个药企，实际上会遇到更复杂的情形。但万变不离其宗，最终监管需要的还是高质量的伴随诊断试剂盒以及它与药效的关联，抓住了这两个线索，那么就可以用清晰的逻辑和证据来向监管机构阐明双靶点伴随诊断的申报策略。

04 LAG-3检测方法和抗体选择

根据文献报道，LAG-3选择性表达在活化的T淋巴细胞、自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）和树突状细胞。与Elisa、WB等蛋白检测方法相比，免疫组化更能对于LAG-3的蛋白表达进行定性和定位，因此目前免疫组化在LAG-3的检测中较为常见。

而在免疫组化中，为了得到特异性染色，获得可靠结论，抗体的选择是至关重要的一环。据不完全统计，目前全球共有1053种LAG-3抗体，用于IHC（免疫组化）、Elisa、WB、FC等蛋白检测方法。

在IHC应用中，17B4为最常用的抗体克隆号，17B4识别人 LAG-3 的第一个 N 端 D1 结构域的 30 个氨基酸外环，此环参与了LAG-3和配体MHCII之间的结合，这也是LAG-3区别于CD4的主要结构[2]。自20世纪90年代起，该克隆被广泛应用于LAG-3表达的检测。此外，D2G4O、EPR20261等克隆也均有不错的表现。药明奥测LAG-3靶点覆盖主流克隆，可为药企提供个性化定制。

05 药明奥测LAG-3抗体RUO试剂盒

目前药明奥测已成功开发LAG-3抗体RUO试剂盒，特异性识别LAG-3靶点，定位准确，灵敏度高。该试剂盒在开发过程中，在宫颈癌、肝细胞癌、结肠腺癌、尿路上皮癌、黑色素瘤等癌种上均进行了抗体特异性检测（图12），并由病理医生阅片，证明该试剂盒在不同癌种上的染色结果均能符合其特性。除手工版外，还配备机载版试剂盒，用于免疫组化染色机的批量样本检测。

药明奥测LAG-3试剂盒开放与药企合作伙伴进行CDx三类伴随诊断共同开发，欢迎各药企合作伙伴垂询。

图9：LAG-3抗体试剂盒染色结果40x（药明奥测内部数据）